CD44 protein is a group of widely distributed proteins with molecular weight of (85 ~ 160) × 10kd is a multi molecular form of membrane integrin with high sugar content. The molecular weight of CD44 ranges from 85 to 250 KD. It mediates the interaction between cells and between cells and extracellular matrix. It is also a glycoprotein composed of extracellular, transmembrane and cytoplasmic parts. The sugar chain is chondroitin sulfate and heparan sulfate.

检测原理：

本试剂盒采用双抗体“夹心法”，把捕获抗体包被于酶标板上，加入待检样品及标准品于酶标板反应孔中、捕获抗体捕获对应目的蛋白，生物素标记的检测抗体与目的蛋白结合，检测抗体再和SABC结合，形成捕获抗体-目的蛋白-检测抗体-SABC复合物，经过洗液洗涤后，未结合的成分均被洗去，加入显色底物TMB，TMB在辣根过氧化物酶的催化下呈现蓝色，加终止液后变成黄色。用酶标仪在450 nm波长处测OD值，颜色的深浅和样品中的目的蛋白浓度呈正相关，通过绘制标准曲线计算出样品中目的蛋白的浓度，从而进行定性或半定量分析。

 

样品的收集和保存：

1.血清样品:将收集于血清分离管中的全血标本在室温放置 2 小时或 4℃ 过夜，然后 1,000×g 离心 15 分钟，取上清即可，将上清置于≤-20℃冷冻保存，避免反复冻融。

2.血浆样品:用 EDTA或肝素钠抗凝管采集标本，并将标本在采集后的 30 分钟内于 4℃冰箱，1,000×g 离心 15 分钟， 取上清即可检测，或将上清置于≤-20℃冷冻保存，避免反复冻融。

3.组织匀浆:
A、在预冷 PBS(0.01mol/L， pH=7.0-7.2)中清洗去除血液，低温切割标本后，准确称取组织重量。

B、按重量(g):体积(mL)=1:9的比例，加入9倍体积的匀浆介质PBS。用手工或匀浆器将标本充分匀浆。

C、3000 ×g离心15分钟，仔细收集匀浆上清，弃沉淀，（如需要可取部分进行BCA蛋白定量），≤-20℃以下保存。

4.细胞裂解液:在分析试验之前，细胞需利用以下方法处理:
A、贴壁细胞应该用冷 PBS 轻轻清洗 ，然后用胰蛋白酶消化，于 1,000×g 离心 5 分钟后收集，(悬浮细胞通过离心直接收集)，将收集到的细胞用冷 PBS 洗3次。

B、用 PBS 稀释细胞悬液，细胞浓度达到 100 万/ml 左右。通过超声破碎或反复冻融方式，以使细胞破坏并放出细胞内成份。3000 ×g离心15分钟，仔细收集上清，≤-20℃冷冻保存。

5.细胞培养上清或其它生物体液标本:请 3,000×g 离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于≤-20℃冷冻保存，避免反复冻融。

 

检测流程：

1.加    样: 空白孔加入50μl标准品/样品稀释液，其余孔各对应加入标准品或待测样品50ul，将酶标板用封板膜封好，轻轻混匀后置37℃，孵育50分钟。

2.洗    板: 用洗涤液（1×）将酶标板充分洗涤 3 次，每孔加入洗液 300μl，每次震荡/浸泡 1-2 分钟，向滤纸上印干。

3.孵育抗体：空白孔加入100ul的抗体稀释液，其余孔各加入检测抗体工作液 100ul，将酶标板用封板膜封好，轻轻混匀后置37℃，孵育50分钟。

4.洗    板: 同上。

5.孵育SABC：空白孔加入100ul的SABC稀释液，其余孔各加入SABC工作液 100ul，将酶标板用封板膜封好，轻轻混匀后置37℃，孵育30分钟。

6.洗    板: 同上。

7.显    色：每孔加入提前配置好的TMB混合液100ul，将酶标板用封板膜封好，  轻轻混匀后置37℃，暗处反应8-20分钟，反应结果为蓝色。

8.终止反应：每孔加入50ul 终止液，轻轻混匀，此时蓝色转为黄色，20 分钟内用酶标仪在 450nm 处测OD值。

注意事项：

l加样:实验操作中请使用一次性的吸头，避免交叉污染。加样时注意不要有气泡，将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。加样或加试剂时，第一个孔与最后一个孔加样之间的时间间隔如果太大， 将会导致不同的“孵育”时间，从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。因此，一次加样时间(包括标准品及所有样品)最好控制在10分钟内。

l孵育:为防止样品蒸发，实验时请将封板膜封好，以避免液体蒸发，洗板后应尽快进行下步操作，任何时侯都应避免酶标板处于干燥状态，同时应严格遵守孵育时间和温度。

l洗涤:充分的洗涤非常重要，在每次洗涤过程中，都要将洗涤液完全甩干，洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在滤纸上拍干，勿将滤纸直接放入反应孔中吸水，同时要消除板底残留的液体和手指印，避免影响最后的酶标仪读数。

l显色时间的控制: 说明书中显色时间供参考，因用户实验室条件差异，最佳显色时间会有所不同，加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化(比如，每隔5分钟观察一次)，如颜色较深，请提前终止反应。当标准曲线有明显梯度且S7孔肉眼可见淡淡的蓝色时便可终止反应，避免反应过强从而影响酶标仪光密度读数。

l本试剂盒中使用了酸作为终止液，具有腐蚀性，使用时应避免接触衣物或眼、手等皮肤暴露部位。

 

试剂盒的储存及有效期：

1、未拆封的试剂盒4℃保存，6个月有效。

2、拆封后的试剂盒，请将未使用酶标条用自封袋装好， 1个月内有效。