检测原理：

本试剂盒采用双抗体“夹心法”，把捕获抗体包被于酶标板上，加入待检样品及标准品于酶标板反应孔中、捕获抗体捕获对应目的蛋白，生物素标记的检测抗体与目的蛋白结合，检测抗体再和SABC结合，形成捕获抗体-目的蛋白-检测抗体-SABC复合物，经过洗液洗涤后，未结合的成分均被洗去，加入显色底物TMB，TMB在辣根过氧化物酶的催化下呈现蓝色，加终止液后变成黄色。用酶标仪在450 nm波长处测OD值，颜色的深浅和样品中的目的蛋白浓度呈正相关，通过绘制标准曲线计算出样品中目的蛋白的浓度，从而进行定性或半定量分析。

样品的收集和保存：

1.血清样品:将收集于血清分离管中的全血标本在室温放置 2 小时或 4℃ 过夜，然后 1,000×g 离心 15 分钟，取上清即可，将上清置于≤-20℃冷冻保存，避免反复冻融。

2.血浆样品:用 EDTA或肝素钠抗凝管采集标本，并将标本在采集后的 30 分钟内于 4℃冰箱，1,000×g 离心 15 分钟， 取上清即可检测，或将上清置于≤-20℃冷冻保存，避免反复冻融。

3.组织匀浆:
A、在预冷 PBS(0.01mol/L， pH=7.0-7.2)中清洗去除血液，低温切割标本后，准确称取组织重量。

B、按重量(g):体积(mL)=1:9的比例，加入9倍体积的匀浆介质PBS。用手工或匀浆器将标本充分匀浆。

C、3000 ×g离心15分钟，仔细收集匀浆上清，弃沉淀，（如需要可取部分进行BCA蛋白定量），≤-20℃以下保存。

4.细胞裂解液:在分析试验之前，细胞需利用以下方法处理:
A、贴壁细胞应该用冷 PBS 轻轻清洗 ，然后用胰蛋白酶消化，于 1,000×g 离心 5 分钟后收集，(悬浮细胞通过离心直接收集)，将收集到的细胞用冷 PBS 洗3次。

B、用 PBS 稀释细胞悬液，细胞浓度达到 100 万/ml 左右。通过超声破碎或反复冻融方式，以使细胞破坏并放出细胞内成份。3000 ×g离心15分钟，仔细收集上清，≤-20℃冷冻保存。

5.细胞培养上清或其它生物体液标本:请 3,000×g 离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于≤-20℃冷冻保存，避免反复冻融。

检测流程：

1.加    样: 空白孔加入50μl标准品/样品稀释液，其余孔各对应加入标准品或待测样品50ul，将酶标板用封板膜封好，轻轻混匀后置37℃，孵育50分钟。

2.洗    板: 用洗涤液（1×）将酶标板充分洗涤 3 次，每孔加入洗液 300μl，每次震荡/浸泡 1-2 分钟，向滤纸上印干。

3.孵育抗体：空白孔加入100ul的抗体稀释液，其余孔各加入检测抗体工作液 100ul，将酶标板用封板膜封好，轻轻混匀后置37℃，孵育50分钟。

4.洗    板: 同上。

5.孵育SABC：空白孔加入100ul的SABC稀释液，其余孔各加入SABC工作液 100ul，将酶标板用封板膜封好，轻轻混匀后置37℃，孵育30分钟。

6.洗    板: 同上。

7.显    色：每孔加入提前配置好的TMB混合液100ul，将酶标板用封板膜封好，  轻轻混匀后置37℃，暗处反应8-20分钟，反应结果为蓝色。

8.终止反应：每孔加入50ul 终止液，轻轻混匀，此时蓝色转为黄色，20 分钟内用酶标仪在 450nm 处测OD值。

注意事项：

l加样:实验操作中请使用一次性的吸头，避免交叉污染。加样时注意不要有气泡，将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。加样或加试剂时，第一个孔与最后一个孔加样之间的时间间隔如果太大， 将会导致不同的“孵育”时间，从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。因此，一次加样时间(包括标准品及所有样品)最好控制在10分钟内。

l孵育:为防止样品蒸发，实验时请将封板膜封好，以避免液体蒸发，洗板后应尽快进行下步操作，任何时侯都应避免酶标板处于干燥状态，同时应严格遵守孵育时间和温度。

l洗涤:充分的洗涤非常重要，在每次洗涤过程中，都要将洗涤液完全甩干，洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在滤纸上拍干，勿将滤纸直接放入反应孔中吸水，同时要消除板底残留的液体和手指印，避免影响最后的酶标仪读数。

l显色时间的控制: 说明书中显色时间供参考，因用户实验室条件差异，最佳显色时间会有所不同，加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化(比如，每隔5分钟观察一次)，如颜色较深，请提前终止反应。当标准曲线有明显梯度且S7孔肉眼可见淡淡的蓝色时便可终止反应，避免反应过强从而影响酶标仪光密度读数。

l本试剂盒中使用了酸作为终止液，具有腐蚀性，使用时应避免接触衣物或眼、手等皮肤暴露部位。

试剂盒的储存及有效期：

1、未拆封的试剂盒4℃保存，6个月有效。

2、拆封后的试剂盒，请将未使用酶标条用自封袋装好， 1个月内有效。