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货号:JHN92344
检测范围:62.5→4000pg/ml
灵敏度:12.5pg/ml
应用:血清/ 血浆/ 细胞培养上清/组织匀浆/其它生物体液
规格:
检测原理:
本试剂盒采用双抗体“夹心法”,把捕获抗体包被于酶标板上,加入待检样品及标准品于酶标板反应孔中、捕获抗体捕获对应目的蛋白,生物素标记的检测抗体与目的蛋白结合,检测抗体再和SABC结合,形成捕获抗体-目的蛋白-检测抗体-SABC复合物,经过洗液洗涤后,未结合的成分均被洗去,加入显色底物TMB,TMB在辣根过氧化物酶的催化下呈现蓝色,加终止液后变成黄色。用酶标仪在450 nm波长处测OD值,颜色的深浅和样品中的目的蛋白浓度呈正相关,通过绘制标准曲线计算出样品中目的蛋白的浓度,从而进行定性或半定量分析。
样品的收集和保存:
1.血清样品:将收集于血清分离管中的全血标本在室温放置 2 小时或 4℃ 过夜,然后 1,000×g 离心 15 分钟,取上清即可,将上清置于≤-20℃冷冻保存,避免反复冻融。
2.血浆样品:用 EDTA或肝素钠抗凝管采集标本,并将标本在采集后的 30 分钟内于 4℃冰箱,1,000×g 离心 15 分钟, 取上清即可检测,或将上清置于≤-20℃冷冻保存,避免反复冻融。
3.组织匀浆:
A、在预冷 PBS(0.01mol/L, pH=7.0-7.2)中清洗去除血液,低温切割标本后,准确称取组织重量。
B、按重量(g):体积(mL)=1:9的比例,加入9倍体积的匀浆介质PBS。用手工或匀浆器将标本充分匀浆。
C、3000 ×g离心15分钟,仔细收集匀浆上清,弃沉淀,(如需要可取部分进行BCA蛋白定量),≤-20℃以下保存。
4.细胞裂解液:在分析试验之前,细胞需利用以下方法处理:
A、贴壁细胞应该用冷 PBS 轻轻清洗 ,然后用胰蛋白酶消化,于 1,000×g 离心 5 分钟后收集,(悬浮细胞通过离心直接收集),将收集到的细胞用冷 PBS 洗3次。
B、用 PBS 稀释细胞悬液,细胞浓度达到 100 万/ml 左右。通过超声破碎或反复冻融方式,以使细胞破坏并放出细胞内成份。3000 ×g离心15分钟,仔细收集上清,≤-20℃冷冻保存。
5.细胞培养上清或其它生物体液标本:请 3,000×g 离心15分钟,取上清即可检测,或将上清置于≤-20℃冷冻保存,避免反复冻融。
检测流程:
1.加 样: 空白孔加入50μl标准品/样品稀释液,其余孔各对应加入标准品或待测样品50ul,将酶标板用封板膜封好,轻轻混匀后置37℃,孵育50分钟。
2.洗 板: 用洗涤液(1×)将酶标板充分洗涤 3 次,每孔加入洗液 300μl,每次震荡/浸泡 1-2 分钟,向滤纸上印干。
3.孵育抗体:空白孔加入100ul的抗体稀释液,其余孔各加入检测抗体工作液 100ul,将酶标板用封板膜封好,轻轻混匀后置37℃,孵育50分钟。
4.洗 板: 同上。
5.孵育SABC:空白孔加入100ul的SABC稀释液,其余孔各加入SABC工作液 100ul,将酶标板用封板膜封好,轻轻混匀后置37℃,孵育30分钟。
6.洗 板: 同上。
7.显 色:每孔加入提前配置好的TMB混合液100ul,将酶标板用封板膜封好, 轻轻混匀后置37℃,暗处反应8-20分钟,反应结果为蓝色。
8.终止反应:每孔加入50ul 终止液,轻轻混匀,此时蓝色转为黄色,20 分钟内用酶标仪在 450nm 处测OD值。
注意事项:
l加样:实验操作中请使用一次性的吸头,避免交叉污染。加样时注意不要有气泡,将样品加于酶标板底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀。加样或加试剂时,第一个孔与最后一个孔加样之间的时间间隔如果太大, 将会导致不同的“孵育”时间,从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。因此,一次加样时间(包括标准品及所有样品)最好控制在10分钟内。
l孵育:为防止样品蒸发,实验时请将封板膜封好,以避免液体蒸发,洗板后应尽快进行下步操作,任何时侯都应避免酶标板处于干燥状态,同时应严格遵守孵育时间和温度。
l洗涤:充分的洗涤非常重要,在每次洗涤过程中,都要将洗涤液完全甩干,洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在滤纸上拍干,勿将滤纸直接放入反应孔中吸水,同时要消除板底残留的液体和手指印,避免影响最后的酶标仪读数。
l显色时间的控制: 说明书中显色时间供参考,因用户实验室条件差异,最佳显色时间会有所不同,加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化(比如,每隔5分钟观察一次),如颜色较深,请提前终止反应。当标准曲线有明显梯度且S7孔肉眼可见淡淡的蓝色时便可终止反应,避免反应过强从而影响酶标仪光密度读数。
l本试剂盒中使用了酸作为终止液,具有腐蚀性,使用时应避免接触衣物或眼、手等皮肤暴露部位。
试剂盒的储存及有效期:
1、未拆封的试剂盒4℃保存,6个月有效。
2、拆封后的试剂盒,请将未使用酶标条用自封袋装好, 1个月内有效。